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技術文章

科學家研究繪制蛋白質相互作用圖像了解**起因

1987年，瑞士研究人員描述了兩個姐妹，她們分別出生但擁有類似的異常。她們小腦中缺失了一圈組織，心臟存在孔和裂縫。其中1人在心臟手術后于三歲去世，她的姐姐在四歲時也做過類似的手術，但活了下來。因為兩名女孩的父母都沒有這些異常，研究人員得出結論，他們的女兒繼承了一種非典型基因的兩個復本，導致了此前不為人知的一種癥狀。

與女孩癥狀相關的核苷酸異常可能存在于一個單獨的基因中。然而，若干其他基因隨后也與這種被稱為“Ritscher—Schinzel綜合征”的基因聯系在一起。多年來，這些基因的功能以及它們如何與該綜合征相關聯一直是個謎。

今天，由于對蛋白質—蛋白質相互作用—— 一門被稱為“相互作用組”的學科——的系統研究，這些分子基礎已經成為關注的焦點。通過繪制蛋白質之間的連接網絡，三個研究小組獨立發現了一個叫做“指揮官”的復合物，它由突變基因產生的蛋白質組成。“指揮官”是一個重要的細胞成分，可以對蛋白質進行分類和傳遞，其功能失調就會導致存在嚴重缺陷的Ritscher–Schinzel綜合征。

過去3年里，研究小組已經發表了**批高質量人類相互作用組學圖像。對這些圖像的綜合已經識別出約9.3萬個獨特的蛋白質—蛋白質相互作用。這并不容易：捕捉到所有的相互作用是一種挑戰，因為一組蛋白質搭檔會隨著不同的組織、細胞甚至是時間而變化。相互作用組是動態的，會隨著細胞對環境的響應而斷開或形成。完全繪制它可能需要思考系統生物學的新方式方法。盡管如此，這個領域仍在不斷產出成果。

數字游戲

有兩種構建相互作用組圖譜的主要方式。酵母雙雜合化驗通過把基因表達與細胞內蛋白質的相互作用相結合，測試了蛋白質對之間的相互作用。**種方法，通過用抗體分離復合物及用質譜儀識別它們的組分繪制了直接和間接的蛋白質接觸。

美國得克薩斯州立大學奧斯汀分校系統生物學家Edward Marcotte的實驗室在**種方法基礎上采用了一個變化，涉及在生物化學上分離蛋白（例如用蔗糖濃度梯度），從而觀察哪些分子傾向于呆在一起。由此產生的圖像讓Marcotte及其實驗室博士后Anna Mallam對“指揮官”復雜的細胞角色進行了推斷。那些數據和其他發現表明，“指揮官”會將特定蛋白質從細胞膜轉移到被稱為高爾基體的空間里，它們在那里被循環利用。

目前，大的圖譜包含了成千上萬的蛋白質，與放射狀的星暴相比，它們更加類似于纏結的毛球。通過解開這些基因，研究人員可以識別出區分致癌基因與“正常”基因的特征，還可以定義關鍵的生物學過程，如細胞分裂期間的染色體隔離。

馬薩諸塞州波士頓丹娜—法伯癌癥研究所計算生物學研究者Katja Luck說，即使有多種方法，相互作用組圖譜“仍然是不完整的”。這是一個關于數字的問題。人類基因組包含約兩萬個蛋白質編碼基因。如果一個人假設每種蛋白質只有一種形式（過于簡化的情況），那么大約有兩億種可能的相互作用。實際數字可能要小得多，因為許多交互都是間接的，一對一交互范圍估計在12萬到100萬之間。

從生物化學方面看，蛋白質是的多樣化令人難以置信，因此它們之間的相互作用不能被每一次的試驗所捕獲。“我們只是剛剛開始理解不同方法的偏差。”Luck說。

基因剪刀
Luck是遺傳學家Marc Vidal實驗室的博士后，Vidal設想的參考圖可能只包含所有潛在的相互作用的子集。細胞和組織的變化以及改變細胞的反應累積成為全部相互作用組的許多可能的版本。對德國馬普學會生物化學研究所生化學家Matthias Mann來說，這些變化令人畏懼。但他對用基因編輯技術的力量，如用CRISPR-Cas9解決這些問題表示樂觀。

Mann的繪圖方法涉及表達了數百種蛋白質的細胞株庫，這些蛋白質是通過一種叫作軌道阱的超高分辨率質譜儀進行測試的。誘餌蛋白質被融合到綠色熒光蛋白，產生一種光度輪廓，讓研究人員能夠通過活細胞成像量化相互作用。在21世紀頭十年后期，創建細胞株庫“相當費力”，他說。“現在，由于有了CRISPR基因工程技術，我們的新方法獲得了雙翼。”

自從2010年引入該量化方法以來，Mann的團隊已經繪制并量化了超過2.8萬個相互作用的強度。一對一比率的蛋白質對的相互作用被認為是“強大”的，可能存在于穩定和豐富的復合體中。Mann解釋說，如果沒有這樣的信息，“很難說這個網絡的結構是怎樣的”。對他所在團隊繪制的圖譜進行的分析顯示，人類相互作用組由弱關聯主導，這可能反映了低豐度調控蛋白???更穩定的蛋白質機器的作用。

細微調整
這一領域的普遍趨勢是采用相對溫和的樣品制備方法，其目的是真實地捕捉細胞中所有蛋白質—蛋白質相互作用。“我們正試圖找到破壞性更低的方法。”加州圣荷西市生命科學公司賽默飛世爾科技公司生物化學家Rosa Viner說。該公司專注于改進樣品制備、工作流程和質譜技術，目的是幫助研究人員識別細胞中存在的相互作用。“這是艱巨的挑戰：找到不需要任何人工現象的情況下讓我們獲得好的照片的方法。”她補充道。

人工現象包括在檢測到它們的相互作用之前就分解的蛋白質復合物。為了把這些復合物凝聚在一起，Viner與加州大學歐文分校的研究人員合作，在質譜分析之前在化學上融合復合物，這種方法叫作交叉連接。一種名為QMIX的策略（多路復用、等比重標記的交叉結合的肽的定量化）已被開發出來，它可以用化學標簽整合交叉結合的化合物，從而使研究人員能夠穩定及跟蹤蛋白質復合物。

好的分析會考慮到任何給定方法的盲區。“仍有一些蛋白質種類非常具有挑戰性。”波士頓哈佛醫學院細胞生物學家Wade Harper說，“當進行高通量分析時，你會被限制在對單個蛋白質有多關注上。”這樣的分析往往會對每個反應進行相同的處理，幾乎沒有定制化的余地。

Harper和哈佛同事Steven Gygi創建了一個實驗室小組調整他們的方法。“我們的團隊規模相對較小，只有4到6人，每個月可以創建400到500個細胞株。”他說。這些努力迄今為止已經通過單個通道產生了大量的人類蛋白質復合物數據集。他們的譜圖名為“bioplex”，包含約12萬個相互作用。

更大圖景
但為了更近一步去看這些相互作用，研究人員必須深入研究細胞自身的擁擠情況。加拿大多倫多大學生化學家Anne-Claude Gingras使用一種名為BioID的技術，該技術基于蛋白質的接近性將其連接到另一個蛋白質上。相關的標記蛋白會給附近的蛋白添加化學標記，留下它相互作用的證據——就像一個揮動著彩筆蹣跚學步的孩童經過房間時候留下的痕跡。其結果是一幅圍繞著初始蛋白的在物理上近鄰的圖像。Gingras解釋說，識別一個蛋白質的更大社區可能揭示其細胞功能的細節。

近距離成像還可以讓研究人員跟蹤那些無法被其他試驗所發現的蛋白，比如難以分離的膜嵌入蛋白。Gingras說：“我們和其他研究人員研究了核染色質上的蛋白，繪制了中心體的組織，探測出跨越各種膜之間的相互作用。”通過使用BioID，該小組在一個信號通路中發現了在發育過程中可調節器官大小的新組分。

Lippincott-Schwartz說，這種相互作用組是細胞生物學家的“假說生成器”。“一旦你看到一種認識的蛋白質與一大堆你不知道其功能的蛋白質相互作用時，你就開始進行測試。”隨著相互作用組圖像而終被高質量、豐富的相互作用所充實，研究人員將能開始驗證那些假說。

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