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PCR應該注意的事項

出現非特異性擴增帶
PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物1)克隆PCR產物的優條件是什么？
摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。
B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為：產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復功???的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。
E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

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