基因編輯技術在植物中的開發和應用，為分子設計育種帶來了變化?；诨蚓庉嫾夹g建立基因精細調控的方法對于精準設計育種至關重要。目前應用*廣泛的基因表達調控方法如CRISPR-Cas、CRISPRi和RNAi等技術，只能實現對基因的完全敲除或將基因的表達抑制到不可預測的水平。利用CRISPR-Cas9技術對啟動子區域進行編輯，可以在轉錄層面將基因的表達調控至不同的水平，并產生大量不可預測的數量性狀變異。而這種方法將耗費大量精力用以篩選理想的突變體。因此，開發新的能夠可預測地精細調控基因表達的方法可以拓展現有的基因表達調控工具箱，為作物遺傳改良提供有力的技術支撐。
上游開放閱讀框（upstream open reading frame，uORF）是真核生物mRNA上普遍存在的翻譯調控元件，對基因主效開放閱讀框（primary open reading frame，pORF）的翻譯具有抑制作用。2018年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組率先利用CRISPR-Cas9技術對uORF進行編輯，建立了精細上調內源基因翻譯的方法，并利用該方法培育出維生素C含量顯著提高的生菜種質（Zhang et al., Nat. Biotechnol., 2018；Si et al., Nat. Protoc., 2020）。2020年，高彩霞研究組將這一技術應用于草莓的遺傳改良，獲得了梯度糖分的系列草莓新種質（Xing et al., Genome Biol., 2020）。近日，高彩霞研究組基于既往研究，進一步開發出能夠可預測地精細下調目標基因蛋白表達的新方法。
uORF的長度及uORF與pORF之間的距離等多種因素均影響uORF對pORF翻譯的抑制能力。因此，研究設想可通過以下兩種策略抑制目標基因的翻譯：一是在目標基因的5’ 非翻譯區（5' untranslated region, 5’ UTR）從頭產生新的uORF；二是原位突變內源uORF的終止密碼子以延伸其表達框長度。原生質體瞬時系統的結果表明，這兩種策略可以有效地將pORF的翻譯抑制到不同的水平，且對其mRNA的表達量幾乎沒有影響。此后，研究利用堿基編輯和引導編輯系統獲得了含有新創制uORF或內源uORF被延伸的水稻突變體植株，通過對突變體植株的蛋白表達水平和表型進行檢測，發現突變體中引入的uORF變體對目標蛋白表達和表型的影響與瞬時系統結果一致。
為了實現對目標基因的表達進行連續的梯度下調，本研究結合以上兩種策略，分別在水稻的OsTCP19、OsTB1和OsDLT基因的5’ UTR區域設計了一系列具有不同抑制能力的uORFs，瞬時系統的結果表明pORF的翻譯水平被梯度地抑制到了原始水平的2.5-84.9%，實現了對基因的梯度敲降。OsDLT基因編碼GRAS蛋白家族成員，參與水稻油菜素內酯信號轉導途徑，調控水稻株高、分蘗數、種子大小等多個重要農藝性狀。該研究以OsDLT基因為靶標，通過編輯OsDLT基因的5’ UTR，獲得了一組具有不同葉夾角、株高和分蘗數的突變體，且突變體的表型變化趨勢與瞬時系統預測結果一致。
該研究通過對uORF進行設計，開發了一種普適的能夠可預測地精細下調基因表達的新方法，為未來的分子設計育種提供了重要的技術手段。3月9日，相關研究成果在線發表在Nature Biotechnology上（DOI：10.1038/s41587-023-01707-w）。研究工作得到國家重點研發計劃、中科院、農業農村部等的支持。
通過編輯uORF培育具有目標性狀的水稻植株。（a、b）從頭創制新的uORFs（a）或延伸內源uORFs（b）抑制目標基因的蛋白表達；（c）通過產生一系列具有不同抑制能力的uORFs梯度下調基因的表達；（d、e）含有uORFs變體的突變體對油菜素內酯的敏感性（d）和植株表型（e）。
