神經(jīng)精神**一直以來缺乏明確的腦病理，并且在很大程度上受遺傳調(diào)控，ASD（自閉癥譜系障礙）作為其中的一類**也不例外，所涉及的風(fēng)險(xiǎn)基因多達(dá)上百個(gè)，因此患者發(fā)病的病因有很大的異質(zhì)性[1,2]。
*近的一些研究報(bào)道了大部分ASD患者大腦額葉皮層和顳葉皮層中存在一致的轉(zhuǎn)錄組和表觀組異常調(diào)控模式，這表明ASD盡管病因異質(zhì)性較大卻可能有較為一致的分子病理[3,4]。但ASD中一致性的分子病理究竟是只限于大腦皮層局部，還是廣泛存在于大腦皮層中仍然需要進(jìn)一步的研究。
近日，由加州大學(xué)洛杉磯分校的Daniel H. Geschwind和Michael J. Gandal領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)，在《自然》期刊上發(fā)表重要研究成果[5]。
他們分析了725份來自112個(gè)ASD患者以及正常人遺體的大腦樣本，涵蓋11個(gè)不同的大腦皮層區(qū)域，利用樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)在大腦皮層中存在廣泛的轉(zhuǎn)錄組變化，并且呈現(xiàn)出從前到后（額葉到枕葉）越發(fā)明顯的趨勢，這比以前所知的要廣泛得多。后續(xù)的單核RNA測序數(shù)據(jù)和甲基化譜則表明，上述分子特征主要影響了興奮性神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
研究人員還認(rèn)為，這個(gè)研究表明，大腦中的廣泛的RNA變化可能是ASD的原因，而不是這種**的結(jié)果[6]。
Geschwind團(tuán)隊(duì)首先對(duì)725份涵蓋11個(gè)大腦皮層區(qū)域（其中包含了額葉、頂葉、顳葉、枕葉四個(gè)皮層小葉）的樣本進(jìn)行了RNA測序，這個(gè)樣本量幾乎是以往研究的3倍，這些樣本來自49個(gè)ASD患者的遺體和54個(gè)相匹配的健康人遺體。
得益于樣本量增加帶來的統(tǒng)計(jì)力增大，研究人員通過比較兩組樣本的基因表達(dá)譜，以及由可變剪接產(chǎn)生的同一個(gè)基因的不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了4223個(gè)基因以及9474個(gè)轉(zhuǎn)錄本在整個(gè)大腦皮層范圍有顯著的差異表達(dá)，并且基因轉(zhuǎn)錄本的差異效應(yīng)比基因要大，表明可變剪接ASD中有著重要作用。
為了比較各個(gè)皮層區(qū)域與皮層整體上的一致性，研究人員計(jì)算了各個(gè)皮層區(qū)域中的ASD患者和正常人之間的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本。
盡管各個(gè)皮層區(qū)域的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本數(shù)量不一致，但是11個(gè)皮層區(qū)域的基因差異效應(yīng)大小與皮層整體是一致的。其中位于枕葉的初級(jí)視皮層（BA17）*明顯，BA17有3264個(gè)差異表達(dá)基因，而有59%都是皮層整體上的差異表達(dá)基因。
Geschwind團(tuán)隊(duì)還在83份來自9例母源15q11-q13重復(fù)綜合征（是ASD的一種常見類型）患者遺體的大腦皮層樣本中，進(jìn)行了上述的差異表達(dá)分析，他們發(fā)現(xiàn)這些樣本中的基因差異效應(yīng)與前面皮層整體基因差異效應(yīng)是一致的。
上述研究結(jié)果表明，ASD患者大腦皮層中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)所呈現(xiàn)的分子病理廣泛存在于大腦皮層的各個(gè)區(qū)域，而并不只限于局部。
在正常人的大腦組織中，皮層的各個(gè)區(qū)域之間存在差異明顯的基因表達(dá)模式，這主要反映了不同區(qū)域的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的差異。Geschwind團(tuán)隊(duì)在之前發(fā)表的工作中報(bào)道了ASD患者的額葉皮層和顳葉皮層之間差異表達(dá)的基因顯著減少，他們將這種現(xiàn)象稱為皮層不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組特性衰減（ARI）。ARI表明ASD患者的額葉皮層以及顳葉皮層的功能，以及區(qū)域之間的連通性發(fā)生了變化。
為了探究ARI是否在ASD患者大腦皮層中廣泛存在，研究人員在正常人樣本和ASD患者樣本中分別選取了相應(yīng)的55對(duì)不同的皮層區(qū)域，通過比較不同區(qū)域的基因表達(dá)譜，分別計(jì)算正常人和ASD患者相對(duì)應(yīng)的不同皮層區(qū)域之間的差異表達(dá)基因數(shù)量，得到ARI的量化描述，然后再以正常樣本和患者樣本之間本身的差異表達(dá)基因數(shù)量分布，作為背景來衡量ARI的顯著性。
*后研究人員發(fā)現(xiàn)了10對(duì)皮層區(qū)域之間發(fā)生顯著的ARI，這表明ASD患者的大腦皮層更傾向于分子水平同質(zhì)化。在10對(duì)發(fā)生顯著ARI的區(qū)域中有9對(duì)都包括了BA17或者BA39/40。
為了研究發(fā)生ARI皮層區(qū)域中基因表達(dá)的變化，研究人員根據(jù)區(qū)域間基因差異效應(yīng)以及相應(yīng)的正常樣本和患者樣本間的差異效應(yīng)，選出了導(dǎo)致ARI的代表性基因。
盡管這些基因在皮層各個(gè)區(qū)域中存在廣泛的異常調(diào)控，但是在靠后的區(qū)域BA17和BA39/40中表現(xiàn)出了更大的變化，即正常人樣本中原本應(yīng)該在BA17和BA39/40中出現(xiàn)相對(duì)于其他區(qū)域更高或更低的表達(dá)的基因，在ASD患者樣本中則和其他區(qū)域的表達(dá)量幾乎一致。
Geschwind團(tuán)隊(duì)還對(duì)ARI基因作了進(jìn)一步的分析，他們按照在正常人樣本的皮層區(qū)域中從前到后表達(dá)量升高或者降低，而在ASD患者樣本的各個(gè)皮層區(qū)域不發(fā)生變化，將ARI基因分為了ARI上調(diào)基因和ARI下調(diào)基因。他們發(fā)現(xiàn)，不論哪一類基因在皮層靠后的區(qū)域（BA17、BA39/40）中，ASD患者樣本相對(duì)與正常人樣本都有著更大的變化。
這表明原本存在于大腦皮層中從前到后的基因表達(dá)梯度，在ASD患者的皮層中衰減消失了。
接著，為了識(shí)別在ASD患者大腦皮層中出現(xiàn)協(xié)同變化的基因模塊，Geschwind團(tuán)隊(duì)對(duì)所有大腦皮層樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)做了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），當(dāng)然分析的基因表達(dá)數(shù)據(jù)還包括可變剪接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)譜。
結(jié)果他們在ASD患者樣本中一共發(fā)現(xiàn)了38個(gè)至少在一個(gè)皮層區(qū)域出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)協(xié)同變化的基因模塊。這些模塊大部分可分為兩類：（1）在所有皮層區(qū)域中都有較為一致的協(xié)同變化的基因模塊為18個(gè)；（2）在不同的皮層區(qū)域協(xié)同變化有較大差異的基因模塊為13個(gè)。
在**類基因模塊中有兩個(gè)模塊——GeneM5（基因模塊）和IsoformM37（轉(zhuǎn)錄本模塊）還顯著富集了ASD相關(guān)的常見遺傳變異。GeneM5在ASD中下調(diào)，其中包括許多與突觸囊泡功能和細(xì)胞骨架，以及突觸可塑性相關(guān)的基因，甚至還顯著富集了一些會(huì)發(fā)生與ASD相關(guān)的罕見的功能破壞性遺傳變異的基因，例如GRINA、MYO5A以及BTRC。IsoformM37則在ASD中上調(diào)，其中包括與熱休克反應(yīng)和蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的基因。
**類基因模塊中，沒有任何一個(gè)基因模塊富集已知的ASD相關(guān)遺傳變異。但是其中有12個(gè)基因模塊顯著富集前面提到的ARI基因，表明這些基因模塊在正常人大腦皮層中應(yīng)該代表著各個(gè)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組特性，而在ASD中這種特性消失了。
12個(gè)基因模塊中有6個(gè)在正常人大腦皮層中靠后區(qū)域高表達(dá)（相對(duì)于靠前區(qū)域），但在ASD患者大腦皮層中則出現(xiàn)了下調(diào)，有4個(gè)則是在正常人大腦皮層中靠前區(qū)域高表達(dá)，但在ASD患者大腦皮層中出現(xiàn)了上調(diào)。
這些結(jié)果再一次表明，ASD患者大腦皮層靠后區(qū)域中發(fā)生了遠(yuǎn)比靠前區(qū)域嚴(yán)重的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，從而導(dǎo)致了ARI。
結(jié)合以往的報(bào)道，Geschwind和他的同事推斷產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是：大腦皮層靠后區(qū)域例如BA17相比于皮層其他區(qū)域是神經(jīng)元*密集的區(qū)域，在小鼠和靈長類動(dòng)物的大腦皮層中觀察到神經(jīng)元密度也有從前到后增加的梯度。因此由ASD帶來的轉(zhuǎn)錄失調(diào)嚴(yán)重性與皮層區(qū)域中神經(jīng)元密度有關(guān)。
他們還通過分析ASD患者大腦皮層中轉(zhuǎn)錄組的變化，和以往報(bào)道的靈長類動(dòng)物皮層各個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元密度數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)性證實(shí)了上述推斷。
Geschwind團(tuán)隊(duì)推測，ASD相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的大范圍失調(diào)，很有可能反映了皮層中各種細(xì)胞比例的變化。那么真相究竟是否如此呢？
為搞清楚上述問題，他們對(duì)來自6個(gè)有明顯基因差異表達(dá)特征的ASD患者，和6個(gè)匹配的正常人大腦皮層的250000個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行了???核RNA測序，這些細(xì)胞涵蓋了額葉、頂葉和枕葉皮層。通過對(duì)snRNA-seq數(shù)據(jù)的聚類，他們識(shí)別到了26種不同的細(xì)胞類群，這基本上代表了所有在大腦皮層中出現(xiàn)的細(xì)胞類型。
接著，Geschwind團(tuán)隊(duì)比較了ASD患者和正常人大腦皮層中26種細(xì)胞類型的比例，沒有發(fā)現(xiàn)在FDR校正后仍然顯著的細(xì)胞比例變化，只有星形膠質(zhì)細(xì)胞比例在ASD患者樣本中出現(xiàn)了微弱的上升（FDR>0.18）。
他們還利用之前獲得的包含72個(gè)個(gè)體（ASD患者和正常人各36個(gè)）的bulk-seq的甲基化譜做了細(xì)胞類型分解，比較之后同樣沒有發(fā)現(xiàn)顯著的細(xì)胞比例變化。
Geschwind團(tuán)隊(duì)還考慮了在前面差異基因計(jì)算中加入皮層細(xì)胞比例，作為協(xié)變量來分析細(xì)胞比例對(duì)差異基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞比例加入前后基因差異效應(yīng)log2FC高度相關(guān)（ρ>0.7），這些結(jié)果表明細(xì)胞比例的變化并不能解釋在ASD患者大腦皮層中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄失調(diào)。
他們推測前面發(fā)現(xiàn)的ASD相關(guān)的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，有可能反映了細(xì)胞類型特異的基因表達(dá)變化，于是他們對(duì)在snRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的26中細(xì)胞類型分別計(jì)算了細(xì)胞特異差異表達(dá)基因。結(jié)果他們再次觀察到了皮層的梯度變化——從前到后差異基因越來越多。其中興奮性神經(jīng)元擁有*多的差異基因，并且在枕葉中的興奮性神經(jīng)元更為顯著。
在研究的*后，Geschwind團(tuán)隊(duì)還觀察到前面基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)的96個(gè)基因和轉(zhuǎn)錄本模塊中，有90個(gè)都顯著富集了細(xì)胞特異差異基因。
上述結(jié)果表明，細(xì)胞類型特異的基因差異表達(dá)很大程度上導(dǎo)致了ASD患者大腦皮層中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄失調(diào)，而細(xì)胞類型比例的變化帶來的影響很小。
總的來講，這項(xiàng)研究通過一個(gè)更大規(guī)模的涵蓋ASD患者大腦皮層四個(gè)小葉的樣本隊(duì)列，證明了轉(zhuǎn)錄失調(diào)在ASD患者大腦皮層中廣泛存在，并且靠后區(qū)域的轉(zhuǎn)錄失調(diào)比靠前區(qū)域嚴(yán)重，而這種廣泛的轉(zhuǎn)錄失調(diào)背后是皮層中細(xì)胞類型特異的基因轉(zhuǎn)錄失調(diào)。
