華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室謝卡斌課題組建立了一種陣列式CRISPR文庫(kù)用于大規(guī)模植物基因編輯的方法。利用此方法，該課題組創(chuàng)建了靶向敲除1072個(gè)水稻類受體激酶的基因編輯材料，為快速鑒定抗病、抗逆相關(guān)的基因提供了新資源。基于此，該團(tuán)隊(duì)以“A FLASH pipeline for arrayed CRISPR library construction and the gene function discovery of rice receptor-like kinases”為題在Molecular Plant期刊上在線發(fā)表了研究論文。
隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物中的日益成熟，利用CRISPR文庫(kù)進(jìn)行高通量的遺傳篩選成為可能。目前有兩種 CRISPR 文庫(kù)構(gòu)建策略：混合型文庫(kù)（pooled library）和陣列式文庫(kù)（arrayed library）。其中，混合型的CRISPR/Cas9文庫(kù)已被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室用于水稻、玉米、番茄等作物的突變體庫(kù)的構(gòu)建，但目前尚未有陣列式CRISPR文庫(kù)在植物中應(yīng)用的報(bào)道。
本研究建立了一種陣列式CRISPR庫(kù)的快速構(gòu)建技術(shù)，可同時(shí)用于小規(guī)模和大規(guī)模植物基因編輯材料的創(chuàng)制。作者設(shè)計(jì)了一種PCR片段長(zhǎng)度作為Cas9/gRNA載體標(biāo)簽的策略（PCR fragment-length markers for gRNAs distinguishing，簡(jiǎn)稱FLASH標(biāo)簽），可以通過(guò)常規(guī)PCR和凝膠電泳讀取每個(gè)載體和轉(zhuǎn)化植株的gRNA信息（即靶基因信息）。本研究中，課題組設(shè)計(jì)了12個(gè)含不同F(xiàn)LASH標(biāo)簽的CRISPR/Cas載體，并與96孔板高通量克隆技術(shù)結(jié)合，建立了快速構(gòu)建Cas9/gRNA質(zhì)粒文庫(kù)的方法。本研究還設(shè)計(jì)了將含不同F(xiàn)LASH標(biāo)簽的12個(gè)質(zhì)粒載體混合后轉(zhuǎn)化水稻的策略，通過(guò)PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化植株所含F(xiàn)LASH標(biāo)簽的片段大小即可讀取gRNA信息，極大地簡(jiǎn)化了基因編輯材料的創(chuàng)制過(guò)程。
利用FLASH策略，本研究在一年左右的時(shí)間內(nèi)完成了靶向編輯1072個(gè)水稻類受體激酶的構(gòu)建工作。課題組以12個(gè)載體混合轉(zhuǎn)化水稻的方式，通過(guò)89個(gè)水稻轉(zhuǎn)化事件獲得了5039棵T0代水稻植株；通過(guò)PCR檢測(cè)FLASH標(biāo)簽的方式讀取了每株植物的gRNA信息，成功獲得了955個(gè)RLK基因的編輯水稻。對(duì)部分材料的基因型鑒定結(jié)果表明，目標(biāo)基因的編輯效率在90%以上。
本研究對(duì)脫靶編輯、無(wú)T-DNA整合的基因編輯事件也進(jìn)行了詳細(xì)分析，并對(duì)15個(gè)基因的材料進(jìn)行了稻瘟病接種試驗(yàn)，鑒定到了9個(gè)抗稻瘟病相關(guān)的基因。*后，課題組討論了該方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并提出了構(gòu)建全基因組規(guī)模的陣列式CRISPR文庫(kù)的協(xié)作方案。(生物谷Bioon.com）
